AP 19678215 (руководитель Гриценко Д.А.)

Краткая информация о проекте

(2023-2025 г.г.)

 

Наименование проекта: ИРН AP19678215 «Метагеномный и популяционный анализ вирусов и вироидов картофеля и изучение механизмов их взаимодействия с устойчивыми сортами и гибридами картофеля».

Актуальность.

Данный проект нацелен на решение проблем, связанных с контролем над распространением вирусных инфекций картофеля, предотвращением завоза опасных штаммов и изолятов экономически значимых вирусов и вироидов из других стран, с качественным повышением селекционного потенциала сортов, устойчивых к вирусной инфекции. Интенсификация картофелеводства в стране путем культивирования устойчивых локальных сортов картофеля и контроль над распространением вирусов и их переносчиков позволит прийти к импортозамещению и зависимости от зарубежного семенного материала. Молекулярно-генетическое изучение вирусов картофеля и их взаимодействие с сортами картофеля локальной селекции позволит предотвратить распространение вирусов на картофельных полях, особенно семеноводческих хозяйств.

Цель проекта:

Целью проекта является исследование вирома картофеля, изучение генетического разнообразия  вирусов и вироидов картофеля, распространенных на территории Казахстана, а также механизмов взаимодействия природных изолятов вирусов и вироидов с устойчивыми сортами картофеля и выявление новых генов, ассоциированных с иммунным ответом на вирусную инфекцию.

Ожидаемые результаты:

1) Будет проведен сбор не менее 500 образцов картофеля в картофелеводческих регионах страны (Северный регион и Алматинская область). Метагеномный анализ вирома картофеля, видовая идентификация вирусов и вироидов, распространенных на картофелеводческих полях страны. Обнаружение новых, карантинных и особо опасных вирусов и вироидов. Для отбора будет производиться сбор клубней и надземной части у растений с признаками поражения, а также у бессимптомных растений. Клубни будут использоваться как источник вирионов для инокуляции устойчивых растений.

2) Будет проведено полногеномное секвенирование обнаруженных PLRV, X, Y, S и M вирусов и PSTVd вироида картофеля, приносящих наибольший экономический урон, обнаруженние изолятов и штаммов, циркулирующих в стране. Разработка нового метода vir-типирования вирусов для определения генетического разнообразия изолятов в географически отдаленных популяциях. Сравнение результатов популяционного анализа при vir-типировании и полногеномном секвенировании. Новый метод типирования позволит в разы снизить затраты на изучение популяционной генетики вирусов. Определение природных штаммов/изолятов со значимыми мутациями в белках, ответственных за амплификацию, передвижение и супрессию РНК-интерференции, выявление влияния мутаций на биологию вируса методом инокуляции. Выявление уровня внутривидовой и межвидовой рекомбинации. Выявление новых рекомбинантных форм. Полногеномное секвенирование позволит выявить консервативные и вариабельные паттерны, влияющие на инфекционные способности вируса.

3) Будет проведено выявление интрогрессных генов устойчивости к экономически важным вирусам и вироидам картофеля у 250 сортов и гибридов картофеля Solanum tuberosum местной и зарубежной селекции. В селекции локальных сортов и гибридов картофеля задействованы разнообразные исходные линии, что приводит к положительной вероятности определения устойчивых аллелей, как это было показано нами при исследовании данных сортов на наличие аллелей устойчивости к X и A вирусам картофеля.

4) Будет проведена инокуляция отобранных сортов картофеля разными комбинациями мутантов в генах, кодирующих белки, ответственные за амплификацию, передвижение и супрессию РНК-интерференции. Определение уровня амплификации и системного передвижения разных изолятов вируса в растениях, несущих гены устойчивости. Определение взаимосвязи активности генов устойчивости в определенной генетической среде (разные сорта) к отобранным изолятам вируса. Выявление влияния генетической среды на активность генов устойчивости. Выявление патогенности отобранных изолятов/штаммов.

5) Будет проведен транскриптомный анализ сортов картофеля, инокулированных изолятами вирусных патогенов, несущих значимые мутации в целевых генах, выявление новых генов, участвующих в устойчивости картофеля к вирусным патогенам, в том числе при инокуляции несколькими вирусами.

6) Будет создан банк образцов новых вирусных патогенов, штаммов и изолятов. Разработка методик для селекционеров с описанием генетических паспортов по генам устойчивости к экономически значимым вирусам и степени устойчивости для каждого сорта.

Научный руководитель проекта:

Гриценко Диляра Александровна

Члены исследовательской группы:  

Гриценко Д.А. – заведующая лабораторией

Низамдинова Г, К. — СНС

Пожарский А.С.- НС

Таскужина А.К.- МНС

Капытина А.И.- МНС

Керімбек Н.М- МНС

Костюкова В.С.- МНС

Колченко М.В. — лаборант

Абдрахманова А. Б.- лаборант

Адильбаева К.- лаборант

Махамбетов А.Н.- лаборант

 Список публикаций и патентов исполнителей проекта за период 2018-2022 гг.

1. Gritsenko, D., et al. Development of a “deconstructed” vector based on the genome of grapevine virus A // Plant Biotechnol Rep. -2019. Индекс цитирования – 2, Процентиль – 64, Квартиль- Q2, DOI: 10.1007/s11816-019-00528-1.
2. Pozharskiy, A., Kostyukova, V., Nizamdinova, G., Kalendar, R., & Gritsenko, D. (2022). MLO proteins from tomato (Solanum lycopersicum L.) and related species in the broad phylogenetic context. Plants, 11(12), 1588.. DOI: 10.3390/plants11121588; WOS. Q1 (IF 4,827), Scopus: процентиль 71.
3. Gritsenko, D., Pozharskiy, A., Dolgikh, S., Aubakirova, K., Kenzhebekova, R., Galiakparov, N., Sadykov, S. Apple varieties from Kazakhstan and their relation to foreign cultivars assessed with RosBREED 10K SNP array. 2022. Eur.J.Hortic.Sci. 87 (1) 1-8, DOI: 10.17660/eJHS.2022/006. Индекс цитирования – 0, Процентиль – 62, Квартиль- Q2.
4. Pozharskiy, A., Kostyukova, V., Taskuzhina, A., Nizamdinova, G., Kisselyova, N., Kalendar, R., Gritsenko, D. (2022). Screening a collection of local and foreign varieties of Solanum lycopersicum L. in Kazakhstan for genetic markers of resistance against three tomato viruses. Heliyon. DOI: 10.1016/j.heliyon.2022.e10095; WOS. Q2 (IF-3.7), Scopus: процентиль 82.
5. Gritsenko, D., Zulfiya Kachiyeva, Gulzhan Zhamanbayev, Bakhytzhan DuisembekoV, Abai Sagitov. Detection of five potato viruses in Kazakhstan // IX International scientific agriculture symposium “AGROSYM 2018”., p. 611. 2018.
6. Gritsenko D., Aubakirova K., Galiakrapov N. Simultaneous detection of five apple viruses by RT-PCR. International Journal of Biology and Chemistry (2020) v. 13, n. 1, p. 129-134. 2020. Индекс цитирования –0, doi: 10.26577/ijbch.2020.v13.i1.13.
7. 7. Gritsenko, D., et al. «Detection of Grapevine virus A in wild grape in Kazakhstan.» Phytopathology. Vol. 109. No. 11. 3340 Pilot Knob Road, St Paul, Mn 55121 Usa: Amer Phytopathological Soc, 2019.
8. Gritsenko, D. A., K. P. Aubakirova, and A. S. Pozharskiy. «SSR profiling of potato cultivars resistant to pathogens.» Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology. 2021.
9. A.S. Pozharskiy, K. Aubakirova, D. Gritsenko, N. Galiakparov. Genotyping and morphometric analysis of Kazakhstani grapevine cultivars versus Asian and European cultivars // Genet. Mol. Res., 2020. Индекс цитирования – 0, DOI: 10.4238/gmr18482.
10. A. Pozharskiy, D. Gritsenko // Prediction of Slmlo1 protein paralogs in Solanum l. Spp. using partially assembled genomic dat // IV. International Agricultural, Biological & Life Science Conference – 2022 – P.162.
11. A. Kapytina, N. Kerimbek, A. Taskuzhina, G. Nizamdinova, K. Adilbayeva, S. Murzatayeva, Z. Kachiyeva // Detection and genetic investigation of potato leafroll virus in Kazakhstan // IV. International Agricultural, Biological & Life Science Conference – 2022 – P.165.
12. Керимбек Н., Капытина А., Пожарский А., Хуснитдинова М., Гриценко Д. // Филогенетический анализ вируса кустистой карликовости малины // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы и перспективы развития науки в области плодоовощеводства» -2022 – С.139

Достигнутые результаты за 2023 г.:

Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей полного генома или  отдельных регионов для вируса PLRV в количестве 296, для вируса PVX- 720, PVY – 632, PVS – 439, PVM – 276, PSTVd – 2864. В результате анализа было выявлено не менее 5 перспективных регионов для дизайна праймеров для каждого целевого патогена. Вариабельность в пределах геномов составила от 3,4 до 15,3 %, в пределах отдельных генов не превышала в среднем 4,7%. Для дизайна праймеров использовался регион, консервативность которого в разрезе вида составляла не менее 99,5% при анализе разных штаммов и изолятов, вариабельность за пределами вида составляла не менее 60%.

В результате анализа для лабораторной коллекции картофеля были выявлены вирусы PLRV (11%), PVX (37%), PVY (29%) и Alfalfa mosaic virus (4%). Гомология среди изолятов каждого вируса PLRV, PVX и PVY при полногеномном анализе составила 87 — 95%. Среди изолятов PLRV частота мутаций не превышала 1.3 × 10−3 , для PVX  1.01 × 10−3 , для вируса PVY 1.15 × 10−3. Наибольшая частота мутаций была отмечена у вируса PLRV.

Был проведен метагеномный анализ надземной части растений, а также клубней картофеля, собранных с полей. В результате анализа были выявлены вирусы PLRV, X, Y, S, а также вироид PSTVd. В северном регионе страны доминируют вирусы X и Y, в то время как в южном регионе (Нарынколь) доминирует вирус X. Помимо вышеуказанных вирусов, также был выявлен вирус Alfalfa mosaic virus.

Полногеномный анализ вирусов PLRV, PVX и PVY показал высокую гомологию внутри каждой исследуемой популяции изолятов, которая составила 97 — 100%. Среди изолятов PLRV частота мутаций варьировала от  0.95 × 10−3  до 1.19 × 10−3 , для PVX от 0.82 × 10−3  до 0.98 × 10−3 , для вируса PVY не превышала 0.92 × 10−3.

Достигнутые результаты за 2024 год

Было проведено полногеномное секвенирование 43, 48 и 11 изолятов вирусов S, M и вироида PSTVd, с глубиной покрытия генома от 180 до 250Х, обеспечившей полное покрытие генома (100%). В результате Vir-типирования было получено 132 полиморфных ампликона для вируса S, 161 для вируса M и 115 для PSTVd. Вирус M показал высокий уровень вариативности как внутри регионов (Северный и Южный), так и между ними, с генетической дистанцией 0,124, при этом гомология внутри регионов не превышала 89%. Филогенетический анализ показал, что локальные изоляты вируса S образуют субклады с изолятами PVSI, а изоляты вируса M — с изолятами PVM-o. Для вируса Х была установлена генетическая дистанция между популяциями (0,198) и выделение отдельных клад для каждого региона. Локальные изоляты вируса Y сформировали субгруппы с филлогруппой I-1, а генетическая дистанция внутри популяции составила 0,087. Наибольшее родство с изолятами было найдено с филлогруппой O. Для вируса PLRV наибольшую вариабельность продемонстрировали открытые рамки считывания, кодирующие RTD и P0, с уровнями вариабельности 35,62% и 27,615% соответственно, с выявлением 9 значимых мутаций, влияющих на биологическую активность белков. Для вирусов S и M капсидные белки оказались наиболее вариабельными, с уровнями вариабельности 21% и 19,3% соответственно, при этом для вируса M было обнаружено 5 уникальных вариантов, влияющих на биологическую активность белков. Вирус Y показал наибольшую вариабельность в генах, кодирующих белки Р1 и VPg, с уровнями вариабельности 21,3% и 12,1%, но значимых мутаций, влияющих на биологическую активность белков, выявлено не было. Для вируса X наибольшую вариабельность показал ген, кодирующий капсидный белок, с уровнем вариабельности 19,8%, и было выявлено 15 значимых мутаций, влияющих на сборку вирусной частицы и ее передвижение, включая 3 мутации в предполагаемом регионе взаимодействия с геномом. Для исследования было отобрано 50 образцов картофеля. Выборка включала сорта и гибриды с различными агрономическими характеристиками, адаптированные к климатическим условиям Казахстана. Основные сорта включают как раннеспелые, так и позднеспелые сорта с различной урожайностью и полевой устойчивостью к основным вирусным патогенам. Для подтверждения качества геномной ДНК и их пригодности к дальнейшему анализу был проведен качественный контроль путем амплификации гена домашнего хозяйства 28rRNA. Для скрининга генов, отвечающих за устойчивость к вирусам картофеля были отобраны следующие маркеры: для устойчивости к вирусу Y –  ADG1, ADG2, RysC3, RY186, GP122/718, GP122/564, SCARysto4; для вируса X – SPUD237, CP60, PVX; для вируса PRLV – RGASC850; и для вируса PVS – SC811/260, CP16. Результаты показали, что сорта Максим, Ресурс, Беркут, а также гибрид Ts-6 имеют наибольшее количество локусов, связанных с устойчивостью к данным вирусным патогенам. Клубни инфицированного картофеля проращивали в контролируемых условиях в климат камере. Для проращивания использовали образцы, которые были ранее протестированы на наличие вирусных патогенов, с каждого региона было отобрано не менее 10 клубней, инфицированных каждым вирусом по-отдельности, а также клубни, зараженные несколькими вирусами одновременно.

Публикации и патенты

l  Adilbayeva, K., Moisseyev, R., Kolchenko, M., Kenzhebekova, R., Khassanov, V., Beisembina, B., … & Gritsenko, D. (2024). Genetic Evaluation of Kazakhstani Potato Germplasm for Pathogen and Pest Resistance Using DNA Markers. Agronomy, 14(9), 1923.

2 Кенжебекова, Р. Т., Мендыбаева, А. С., Капытина, А. И., & Гриценко, Д. А. (2024). Распространение смешанных вирусных инфекций картофеля в алматинской области казахстана. Вестник КазНУ. Серия биологическая, 99(2), 91-100.

 

Полученные результаты по задачам 2025:

Был проведен транскриптомный анализ сортов картофеля, инфицированных вирусами PVY, PVX, PVS, PLRV и PVM на 21 dpi, с целью выявления экспрессии генов, связанных с механизмами устойчивости к вирусным инфекциям. Данный анализ позволил установить закономерности регуляции генов, участвующих в механизмах противовирусной устойчивости, и выявил существенные различия между сортами по уровню транскрипционной активности.

На основе данных высокопроизводительного секвенирования были построены профили экспрессии генов, проведен анализ корреляций между транскрипционными паттернами, а также выполнено функциональное аннотирование наиболее экспрессируемых генов в среднем для всех вирусов и их комбинаций.

Анализ профилей экспрессии позволил выделить восемнадцать наиболее активно транскрибируемых генов у исследованных сортов картофеля. Уровень транскрипционной активности значительно варьировал между генотипами: наибольшие значения экспрессии отмечены у сортов Беркут и Жигулевский, тогда как у сортов Дина и Максим  наблюдались минимальные показатели.

Функциональный анализ наиболее экспрессируемых генов показал, что активные транскрипты преимущественно вовлечены в ключевые метаболические и регуляторные процессы, обеспечивающие адаптацию растения к биотическим стрессам, включая вирусную инфекцию.

Проведенный корреляционный анализ показал, что между сортами картофеля наблюдается высокая степень сопряженности экспрессии основных генов, участвующих в противовирусной защите и фотосинтезе.

На основе результатов молекулярной детекции, полногеномного секвенирования и метагеномного анализа создан банк образцов исследованных патогенов, включающий молекулярно охарактеризованные изоляты вирусов PLRV, PVX, PVY, PVS, PVM и вироида PSTVd.

Были опубликованы научно-методические рекомендации, предназначенные для использования в селекции, направленные на молекулярно-генетическую паспортизацию сортов, гибридов и линий картофеля по генам устойчивости к экономически значимым вирусам с оценкой степени устойчивости каждого генотипа.

Информация для потенциальных пользователей

Потенциал применения результатов проекта в научной и производственной среде является значительным. Разработанные тест-системы могут быть внедрены в мониторинг вирусных инфекций картофеля для оперативного выявления угроз и предотвращения их распространения на посевных площадях. Выявленные генотипы картофеля, несущие гены устойчивости к экономически значимым вирусынм патогенам, являются важной базой для направленной селекции высокоурожайных сортов. Полученные научные материалы и методические разработки доступны для использования в высших учебных заведениях Республики Казахстан.

Эффективность проведённых исследований подтверждается выполнением всех этапов проекта и получением высокозначимых научных результатов опубликованных в высокорейтинговых изданиях. Проведённый комплексный генетический анализ изолятов вирусов и вироидов картофеля позволил выявить новые варианты патогенов, характерных для Казахстана, а также определить их связь со степенью устойчивости у различных сортов местной и зарубежной селекции. Были выявлены гены, участвующие в формировании иммуннитета растений к вирусной инфекции, включая случаи смешанных инфекций. Полученные результаты формируют научную основу для разработки инновационных методов селекции и производства оздоровленного посадочного материала без необходимости вмешательства в геном картофеля, что повышает технологическую и экономическую эффективность защиты растений от вирусных заболеваний.

            Патенты:

• Гриценко Д.А., Керімбек Н.М., Адильбаева К.С., Дулат Б. Патент на полезную модель № 10787 (2025) «Набор синтетических олигонуклеотидов для обнаружения вируса скручивания листьев картофеля»

Научно-методические рекомендации:

1) Адильбаева К.С., Моисеев Р.М., Капытына А.И., Проценко Е.В., Гриценко Д.А. (2025). Молекулярно-генетическая паспортизация сортов, гибридов и линий картофеля отечественной и зарубежной селекции. — Алматы: Жебе,  — 76 с. — ISBN 978-601-08-5440-6.