Краткая информация о проекте
(2023-2025 г.г.)
Наименование проекта: ИРН AP19679755 «Полногеномное и молекулярно-генетическое изучение Erwnina amylovora и грибковых патогенов рода Venturia в диких и культурных популяциях плодовых деревьев».
Актуальность.
Данный проект нацелен на решение проблем, связанных с распространением экономически значимых и карантинных фитопатогенов в стране, предотвращением завоза в страну новых и высокопатогенных штаммов, с распространением инфекции в диких популяциях плодовых деревьев, что приводит к сокращению генетического и биологического разнообразия. Результаты данного проекта позволят выявить новые варианты и гены вирулентности и патогенности возбудителей бактериального ожога и парши, что позволит разработать направленные методы борьбы с ними. Предотвращение распространение инфекции в культурных садах и диких популяций будет осуществлено путем анализа естественных резервуарах патогенов и выявления очагов инф екции в естественных и искусственно созданных условиях. Выявление новых рас и штаммов позволит оценить их уровень патогенности и своевременно ограничить их распространение. В настоящий момент, в стране не определяются риботипы, штаммы Erwnina amylovora, а также расы грибкового патогена рода Venturia, не определяется регион их распространения и применяются одинаковые методы борьбы без полной эрадикации инфекции, что приводит к гибели целых садов. Полногеномные исследования позволят оценить темпы эволюции патогена в стране и предсказать возникновение высокопатогенных штаммов.
Цель проекта:
Целью проекта является полногеномное и молекулярно-генетическое изучение разных штаммов и изолятов Erwnina amylovora, Venturia inaequalis, Venturia pirina и Venturia asperata циркулирующих в диких и культурных популяциях яблони и груши, а также в естественных резервуарах для анализа эволюции и патогенности возбудителей бактериального ожога и парши плодовых культур.
Ожидаемые результаты:
1) Будет проведен сбор не менее 600 образцов растительного материала в популяциях дикой яблони на территории Джунгарского и Заилийского Алатау, а также у культурной яблони и груши в садах южного Казахстана. Сбор растительного материала у растений Рябины и Боярышника, естественных резервуарах патогена Erwnina amylovora. Будут отбираться образцы цветков, веточек и листьев в весеннее и летнее время. Для каждого дерева будут отмечены GPS координаты. Сбор образцов в естественных резервуарах будет производиться у растений, произрастающих в непосредственной близости с популяциями яблони и груши, а также удаленных не менее чем на 1 км от популяций дикой и культурной яблони.
2) Будет проведен метагеномный анализ надземной части растений и определение основных бактериальных и грибковых патогенов, поражающих яблоню, грушу, боярышник и рябину. Выявление новых бактерий и грибков, ранее не изученных в Казахстане, определение сопутствующей микрофлоры и смешанной инфекции. Образцы положительные на наличие Erwnina amylovora и рода Venturia будут анализироваться дополнительно петлевой изотермической амплификацией со специфичными праймерами к геному патогена. Для метагеномного анализа будет проводиться амплификация полного гена 16S РНК бактериальных и ITS регионов грибковых патогенов методом нанопорового секвенирования для повышения видовой разрешающей способности. Будут выявлены образцы со смешанной инфекцией, включающей бактериальный ожог и паршу.
3) Будет проведено полногеномное секвенирование штаммов и изолятов Erwnina amylovora, Venturia inaequalis, Venturia pirina и Venturia asperata, обнаруженных у растений яблони, груши, рябины и боярышника. Будет проведен популяционный и филогенетический анализы с определением уровня гетерогенности и эволюционного вектора патогенов. Выявление высоковариабельных и консервативных регионов геномов, уровень вариабельности всего генома и в зависимости от хозяина и региона распространения. Будут определены значимые мутации в генах вирулентности, выявлены новые варианты. Будут определены перспективные регионы геномов для высокочувствительной детекции патогенов. Будут впервые в стране идентифицированы известные и новые расы рода Venturia и риботипы Erwnina amylovora.
4) Будет проведен анализ экспрессии генов вирулентности патогенов в условиях in vitro и у зараженных образцов яблони и груши, определение транскриптомных профилей с выявлением новых вариантов генов вирулентности и их сочетаний. Будет проведен сравнительный анализ экспрессии генов вирулентности у разных штаммов и изолятов.
5) Будет разработана информационная карта циркуляции Erwnina amylovora и грибковых патогенов рода Venturia в популяциях дикой и культурной яблони и груши в стране.
6) Будут получены чистые культуры патогенов и создана коллекция штаммов, риботипов и изолятов, распространенных в стране. Коллекция патогенов будет являться референтной для анализа эволюции патогенов, идентификации новых рас и штаммов, предсказания вектора эволюции.
Научный руководитель проекта:
Низамдинова Гульназ Карамидиновна
Члены исследовательской группы:
Гриценко Д.А.- зав. лаб
Низамдинова Г, К.- СНС
Пожарский А.С.- НС
Таскужина А.К.- МНС
Капытина А.И.- МНС
Керімбек Н.М- МНС
Костюкова В.С.- МНС
Колченко М.В.- лаборант
Абдрахманова А. Б.- лаборант
Адильбаева К.- лаборант
Список публикаций и патентов исполнителей проекта за период 2018-2022 гг.
- Gritsenko, D., et al. Development of a “deconstructed” vector based on the genome of grapevine virus A // Plant Biotechnol Rep. -2019. Индекс цитирования – 2, Процентиль – 64, Квартиль- Q2, DOI: 10.1007/s11816-019-00528-1.
- Pozharskiy, A., Kostyukova, V., Nizamdinova, G., Kalendar, R., & Gritsenko, D. (2022). MLO proteins from tomato (Solanum lycopersicum L.) and related species in the broad phylogenetic context. Plants, 11(12), 1588.. DOI: 10.3390/plants11121588; WOS. Q1 (IF 4,827), Scopus: процентиль 71.
- Gritsenko, D., Pozharskiy, A., Dolgikh, S., Aubakirova, K., Kenzhebekova, R., Galiakparov, N., Sadykov, S. Apple varieties from Kazakhstan and their relation to foreign cultivars assessed with RosBREED 10K SNP array. 2022. Eur.J.Hortic.Sci. 87 (1) 1-8, DOI: 10.17660/eJHS.2022/006. Индекс цитирования – 0, Процентиль – 62, Квартиль- Q2.
- Pozharskiy, A., Kostyukova, V., Taskuzhina, A., Nizamdinova, G., Kisselyova, N., Kalendar, R., Gritsenko, D. (2022). Screening a collection of local and foreign varieties of Solanum lycopersicum L. in Kazakhstan for genetic markers of resistance against three tomato viruses. Heliyon. DOI: 10.1016/j.heliyon.2022.e10095; WOS. Q2 (IF-3.7), Scopus: процентиль 82.
- Gritsenko, D., Zulfiya Kachiyeva, Gulzhan Zhamanbayev, Bakhytzhan DuisembekoV, Abai Sagitov. Detection of five potato viruses in Kazakhstan // IX International scientific agriculture symposium “AGROSYM 2018”., p. 611. 2018.
- Gritsenko D., Aubakirova K., Galiakrapov N. Simultaneous detection of five apple viruses by RT-PCR. International Journal of Biology and Chemistry (2020) v. 13, n. 1, p. 129-134. 2020. Индекс цитирования –0, doi: 10.26577/ijbch.2020.v13.i1.13.
- Gritsenko, D., et al. «Detection of Grapevine virus A in wild grape in Kazakhstan.» Phytopathology. Vol. 109. No. 11. 3340 Pilot Knob Road, St Paul, Mn 55121 Usa: Amer Phytopathological Soc, 2019.
- Gritsenko, D. A., K. P. Aubakirova, and A. S. Pozharskiy. «SSR profiling of potato cultivars resistant to pathogens.» Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology. 2021.
- A.S. Pozharskiy, K. Aubakirova, D. Gritsenko, N. Galiakparov. Genotyping and morphometric analysis of Kazakhstani grapevine cultivars versus Asian and European cultivars // Genet. Mol. Res., 2020. Индекс цитирования – 0, DOI: 10.4238/gmr18482.
- A. Pozharskiy, D. Gritsenko // Prediction of Slmlo1 protein paralogs in Solanum l. Spp. using partially assembled genomic dat // IV. International Agricultural, Biological & Life Science Conference – 2022 – P.162.
- A. Kapytina, N. Kerimbek, A. Taskuzhina, G. Nizamdinova, K. Adilbayeva, S. Murzatayeva, Z. Kachiyeva // Detection and genetic investigation of potato leafroll virus in Kazakhstan // IV. International Agricultural, Biological & Life Science Conference – 2022 – P.165.
- Керимбек Н., Капытина А., Пожарский А., Хуснитдинова М., Гриценко Д. // Филогенетический анализ вируса кустистой карликовости малины // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы и перспективы развития науки в области плодоовощеводства» -2022 – С.139
Достигнутые результаты за 2023 г.:
Был проведен сбор 890 образцов растительного материала в виде листочков и веточек в садах Алматинской, Жетысуйской и Абайской областях. Были разработаны праймеры для идентификации Erwnina amylovora и Venturia методом азотермической амплификации.
Была проведена валидация разработанных праймеров на положительных контролях коллекции лаборатории, а также на синтетических контролях. Нижний порог чувствительности разработанных праймеров составил 20-40 фг.
Был проведен метагеномный анализ для собранных образцов в садах и в диких популяциях. Метагеномный анализ проводился путем секвенирования генов 16sRNA, а также ITS1-ITS2 на платформе MinIon. Из патогенной микрофлоры, премущественно были выявлены бактерии рода Erwinia, эндофитная микрофлора была представлена Pseudomonas, Klebsiella и Pantoea. Сопутствующая микрофлора была представлена бактериями рода Pseudomonas. У растений в диких популяциях из эндофитной микрофлоры преимущественно была выявлена бактерия Pseudomonas fluorescens. Из патогенных грибков был выявлен род Alternaria, преимущественно вида Alternaria mali, вызывающий альтернариоз яблони. У боярышника и рябины среди патогенных грибков были выявлены Diplocarpon mespili, Alternaria и Monilinia johnsonii. Среди эндофитных грибков были выявлены следующие виды: Alternaria infectoria, Alternaria sclerotigenum, Aspergillus terreus, Penicillium chrysogenum, Fusarium lateritium. В диких популяциях были выявлены все вышеуказанные эндофитные виды грибков, в культурных садах только вид Alternaria infectoria.
В зависимости от исследуемого органа растения состав патогенной и эндофитной микрофлоры варьировал. В листьях были обнаружены: Pseudomonas, Klebsiella, Pantoea, Alternaria sclerotigenum, Aspergillus terreus. Alternaria mali. В то время как в веточках были выявлены: Erwinia, Pseudomonas fluorescens, Alternaria infectoria, Alternaria sclerotigenum, Aspergillus terreus, Penicillium chrysogenum, Fusarium lateritium.
Выявленные изоляты Erwnina amylovora были подтверждены также методом LAMP при использовании разработанных высокоспецифичных праймеров.
Публикации (2023 г.):
